https://bezpecnostpotravin.cz/files/2023/07/GMO_lista_kukurice-300x156.png 300w, https://bezpecnostpotravin.cz/files/2023/07/GMO_lista_kukurice-768x400.png 768w" alt="" width="907" height="472" class="wp-image-43968" style="box-sizing: border-box; height: auto; max-width: 100%; border: 0px; display: inline-block; vertical-align: bottom; contain-intrinsic-size: 3000px 1500px;" loading="lazy" decoding="async" />
Tým vědců z Purdue University představil inovativní diagnostický systém, který umožňuje identifikaci specifických genetických modifikací u kukuřice a sóji přímo v polních podmínkách. Zařízení využívá technologii izotermické amplifikace (LAMP) a papírový mikrofluidní nosič, čímž se eliminuje potřeba purifikace nukleových kyselin před detekční reakcí. Výzkum vedl Mohit Verma, docent zemědělského a biologického inženýrství, spolu s postdoktorandem Bilalem Ahmedem a experty z divize Bayer Crop Science. Detaily systému byly publikovány v odborném časopise Biosensors and Bioelectronics.
Ačkoli je aktuální aplikace zaměřena na geneticky modifikované (GM) plodiny, obdobná technologická platforma laboratoře Mohita Vermy má širší historii v rámci iniciativy „One Health“, která zkoumá propojení zdraví lidí, zvířat a rostlin. Předtím, než byl tento systém adaptován pro rostlinný materiál, byly obdobné biosenzory na bázi LAMP úspěšně vyvinuty pro veterinární medicínu (detekce vysoce patogenní ptačí chřipky a respiračních onemocnění skotu), bezpečnost potravin (identifikace fekální kontaminace na zemědělských produktech) a humánní diagnostiku (rychlá detekce viru SARS-CoV-2 (COVID-19)). Aktuální studie o detekci kukuřice a sóji je pak vůbec první demonstrací využití těchto biosenzorů na rostlinném materiálu v rámci této laboratoře.
V molekulární biologii je za „zlatý standard“ pro detekci specifických sekvencí nukleových kyselin obecně považována polymerázová řetězová reakce (PCR). PCR je však pro terénní použití limitována vyšší cenou vybavení a nutností pracovat s purifikovanou DNA.
Metoda LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) nabízí pro detekci v polních podmínkách některé důležité výhody:
• Izotermický průběh: Na rozdíl od PCR nevyžaduje LAMP reakce opakované střídání teplot, což zjednodušuje a zlevňuje nezbytný hardware.
• Vizuální detekce: Výsledky jsou přímo viditelné na mikrofluidní papírové kazetě (microfluidic paper-based biosensor cartridge). Pozitivní reakci indikuje změna barvy testovacího proužku. To odlišuje tento systém od jiných metod LAMP, které vyžadují dražší techniky detekce pozitivní reakce.
• Vysoká tolerance k inhibitorům: LAMP umožňuje pracovat se surovým listovým extraktem. Není tedy nutné DNA z tkáně pracně izolovat – stačí listový výstřižek o průměru cca 6 mm, který se zhomogenizuje a zředí vodou v poměru 1:7.
Systém LAMP v tomto provedení neaspiruje na nahrazení PCR v centralizovaných laboratořích, kde je nutná absolutní kvantifikace. Představuje však robustní řešení pro decentralizovanou diagnostiku, kde schopnost detekovat specifickou sekvenci v surovém extraktu „přímo na místě“ může rozhodovat o efektivitě zemědělské produkce.
Celý proces lze rozdělit do následujících fází:
Prvním krokem je odběr vzorku rostlinné tkáně – z listu se vysekne terčík o průměru cca 6 mm. Tento listový terčík se vloží do homogenizační zkumavky (např. Lysing Matrix D s keramickými kuličkami) obsahující 500 μL roztoku SDS. Vzorek je homogenizován po dobu 20 sekund pomocí ručního homogenizátoru. Výsledný surový extrakt se následně ředí vodou v poměru 1:7, což je kritický krok pro zajištění optimální funkčnosti biosenzoru.
Vlastní biosenzor tvoří mikrofluidní papírový proužek z papíru, na kterém jsou již předem imobilizovány vysušením reagencie pro reakci LAMP (včetně Bst DNA polymerázy, dNTPs, primerů a indikátoru fenolové červeně).
Na každou testovací plošku (pad) se napipetuje 7,5 μL naředěného listového extraktu. Tento objem je přesně stanoven tak, aby nedocházelo k vysychání ani ke vzájemné kontaminaci mezi ploškami. Proužek se vloží do akrylátové kazety. Kazeta se z obou stran neprodyšně uzavře pomocí adhezivní PCR fólie, která zabraňuje odpařování vlhkosti a vniknutí vody během inkubace. Uzavřená kazeta se umístí do ohřívacího zařízení, které udržuje konstantní teplotu 65 °C. V laboratorních podmínkách se využívá vodní lázeň, zatímco pro polní použití je určena platforma Sherpa Vision s polovodičovým ohřívačem. Reakce probíhá standardně 60 minut (i když u některých primerů (např. RR1.1) může být limit zkrácen na 40 minut, aby se předešlo tvorbě primerových dimerů).
Detekce je založena na vizuální změně barvy indikačního barviva (fenolová červeň) v důsledku změny pH během masivní amplifikace cílové DNA – barva se změní z načervenalé na žlutou či oranžovou. Uživatel může výsledek odečíst prostým okem přímo na papírových ploškách testovacího proužku.
Tento postup umožňuje zemědělcům provádět molekulární screening s minimálními nároky na laboratorní vybavení, přičemž robustnost metody LAMP zajišťuje, že nečistoty v surovém extraktu neinhibují reakci tak dramaticky, jako v případě klasické PCR. Studie uvádí citlivost metody 97 % a specificitu 100 %.
Biosenzor byl validován pro detekci odrůd sóji Roundup-Ready 1 (RR1) a Roundup-Ready 2 (RR2) a specifického znaku Roundup Hybridization System 1 (RHS1) u kukuřice. Znak RHS1 slouží k prevenci samoopylení – samčí část rostliny (pyl) není rezistentní vůči glyfosátu, takže po postřiku odumírá, zatímco zbytek rostliny přežije. Možnost ověřit přítomnost tohoto znaku přímo na poli je důležitá pro management hybridizace.
Výzkumníci uvádějí, že jejich biosenzor překonává omezení tzv. laterálních průtokových testů (LFD), které jsou založeny na expresi proteinů a které u některých hybridů nemusí fungovat. Proces analýzy poskytuje výsledky za méně než hodinu. Také z ekonomického hlediska je systém velmi konkurenceschopný – jedna testovací reakce stojí přibližně 2,90 USD, zatímco u jiných LAMP metod s kapalinovou detekcí se cena pohybuje mezi 8 až 9 USD.
Tato technologie (byla licencována společnosti Krishi, Inc.) je podle týmu Purdue-Bayer Crop Science přizpůsobitelná pro další GM plodiny nebo znaky, což nabízí praktické řešení pro monitoring GM organismů přímo na poli.
Autor překladu: Petr Žák
Zdroje:
- https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956566325005640?via%3Dihub
- https://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/article/default.asp?ID=21516
- https://ag.purdue.edu/news/2025/09/novel-biosensor-detects-genetically-modified-corn-and-soybean.html
Zdroj: BIOTRIN